發(fā)布日期：2017-05-10

在2013年，來自麻省總醫(yī)院的研究人員發(fā)現(xiàn)使用CRISPR-Cas RNA引導(dǎo)性核酸酶的一個(gè)重要局限：會(huì)在預(yù)期靶點(diǎn)以外的位點(diǎn)上生成多余的DNA突變。此后陸續(xù)有研究直接說明了CRISPR/Cas9存在嚴(yán)重的脫靶性，即該技術(shù)可以發(fā)生非特異性切割，引起基因組非靶向位點(diǎn)的突變，這樣會(huì)造成研究結(jié)果的不確定性以及研究工作的大量增加，這一問題嚴(yán)重地限制了Cas9的應(yīng)用。

因此科學(xué)家們希望能通過全基因組檢測(cè)脫靶剪切，近年來研發(fā)了不少檢測(cè)脫靶剪切酶活性的實(shí)驗(yàn)方法，比如近期Nature Methods報(bào)道的兩項(xiàng)技術(shù)，這些技術(shù)是什么，具有何種優(yōu)勢(shì)，具體讓我們來看看：

GUIDE-seq

以往人們?cè)跈z測(cè)CRISPR-Cas核酸酶誘導(dǎo)的脫靶DNA斷裂時(shí)，往往事先假定脫靶位點(diǎn)與靶標(biāo)位點(diǎn)相似。GUIDE-seq是首個(gè)不需要這樣做的方法，而且它相當(dāng)靈敏 。

一組研究人員利用一種短雙鏈寡核苷酸來標(biāo)記CRISPR-Cas誘導(dǎo)的脫靶斷裂，測(cè)序這些標(biāo)簽所在的基因組區(qū)域，就能夠確定脫靶突變的位置。研究表明，就算某個(gè)脫靶突變的出現(xiàn)頻率低至0.1%，GUIDE-seq也能夠檢測(cè)得到。由于許多脫靶突變發(fā)生在與目標(biāo)位點(diǎn)差異很大的地方，因此脫靶DSB的數(shù)量和位置是很難預(yù)測(cè)的。

現(xiàn)有工具主要是通過分析目標(biāo)序列來預(yù)測(cè)脫靶突變，研究人員將這些工具與GUIDE-seq進(jìn)行了比較。研究顯示，上述工具在預(yù)測(cè)已驗(yàn)證的脫靶位點(diǎn)時(shí)比GUIDE-seq差很多，還會(huì)錯(cuò)誤檢出實(shí)際上不被酶切的位點(diǎn)。此外，研究人員還對(duì)比了GUIDE-seq和ChIP-seq（檢測(cè)蛋白與DNA的結(jié)合），結(jié)果證明ChIP-seq并不是鑒定 CRISPR-Cas脫靶DSB的可靠方法。

Digenome-seq

來自韓國(guó)首爾大學(xué)、首爾基礎(chǔ)科學(xué)研究所等機(jī)構(gòu)的研究人員在Nature旗下子刊《Nature Methods》發(fā)表一項(xiàng)研究，成功證實(shí)CRISPR-Cas9在人類細(xì)胞中有精確的打靶作用，他們開發(fā)出一種強(qiáng)大、敏感、無偏見和具有成本效益的方法——Digenome-seq，可在全基因組范圍內(nèi)檢測(cè)人類細(xì)胞中的CRISPR/Cas9脫靶效應(yīng)。

在這項(xiàng)研究中，研究人員稱，雖然RNA引導(dǎo)的、通過CRISPR-Cas9系統(tǒng)的基因組編輯已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究，但是Cas9核酸酶的全基因組靶向特異性仍然是有爭(zhēng)議的。為此，他們提出一種方法Digenome-seq，利用基因組測(cè)序查找CRISPR-Cas9可能突變產(chǎn)生的打靶和脫靶序列。他們用Cas9核酸酶在試管中消化人類基因組DNA，然后進(jìn)行全基因組測(cè)序。這種體外消化可產(chǎn)生打靶和脫靶序列的獨(dú)特模式，可以通過計(jì)算確定。此外，個(gè)在sgRNA末端添加組成CRISPR-Cas9的鳥嘌呤核苷酸，研究人員成功地制備了這種高度發(fā)達(dá)的可編程核酸酶，在人類基因組中它沒有可測(cè)量的脫靶效應(yīng)。

此后，這一研究組又公布了Digenome-seq升級(jí)版，并且他們用這一技術(shù)同時(shí)分析了11個(gè)CRISPR-Cas9核酸酶在整個(gè)基因組中的特異性，大大節(jié)省了CRISPR脫靶分析所需的時(shí)間和經(jīng)費(fèi)。

研究人員先將基因組DNA從人類細(xì)胞中提取出來，然后用多個(gè)sgRNA-Cas9組合進(jìn)行消化，最后進(jìn)行全基因組測(cè)序。他們用一種新的DNA剪切評(píng)分系統(tǒng)，鑒定了Cas9在基因組中的剪切模式，即打靶和脫靶位點(diǎn)的特性。研究表明，轉(zhuǎn)錄自雙鏈寡核苷酸的sgRNA引起了許多脫靶事件，而轉(zhuǎn)錄自質(zhì)粒模板的sgRNA沒有這樣的問題。多重化Digenome-seq可以捕捉到很多被其他方法漏掉的良性脫靶位點(diǎn)。研究人員還在此基礎(chǔ)上給出了減少CRISPR-Cas9脫靶效應(yīng)的指南。

基于整合酶缺陷型慢病毒載體（IDLV）的技術(shù)

這一技術(shù)可以針對(duì)CRISPR和TALENs兩種技術(shù)：在非同源末端連接（NHEJ）的DNA修復(fù)過程中，線性的雙鏈IDLV基因組能夠優(yōu)先整合到雙鏈斷裂（DSB）中。根據(jù)之前發(fā)表的文章，這些IDLV能夠引入ZFN處理的細(xì)胞，標(biāo)記DSB的位置。之后，利用線性擴(kuò)增介導(dǎo)的PCR，可定位IDLV的整合位點(diǎn)，揭示IFN是否擊中目標(biāo)位點(diǎn)。

受到這種方法的啟發(fā)，美國(guó)希望之城貝克曼研究所和浙江大學(xué)第一附屬醫(yī)院的研究人員將其修改后應(yīng)用于CRISPR和TALENs。

研究人員利用表達(dá)CRISPR/Cas9核酸酶或TALENs的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK細(xì)胞，之后轉(zhuǎn)導(dǎo)了IDLV。這個(gè)IDLV攜帶的基因賦予了抗生素和嘌呤霉素的抗性。核酸酶形成DSB后，允許IDLV整合，使得耐受嘌呤霉素的克隆數(shù)量增加了兩到三倍。

對(duì)于CRISPR/Cas9和TALEN處理過的細(xì)胞，研究人員在目標(biāo)切割位點(diǎn)的60 bp內(nèi)鑒定出成簇的IDLV整合位點(diǎn)（CLIS）。當(dāng)他們尋找WAS和TAT基因以外的CLIS時(shí)，在TALEN處理的細(xì)胞中未找到脫靶位點(diǎn)，而在CRISPR/Cas9核酸酶中發(fā)現(xiàn)一些。之后他們利用芯片預(yù)測(cè)和深度測(cè)序來確定IDLV分析的靈敏度，發(fā)現(xiàn)它能夠檢測(cè)頻率低至1%的脫靶切割。

BLESS

科學(xué)家提出一種利用全基因組技術(shù)進(jìn)行DNA雙鏈斷裂(DSBs)作圖新方法，這種作圖法以單核苷酸為基本單位，稱之為BLESS(direct in situ breaks labeling, enrichment on streptavidin and next-generation sequencing)。

研究人員利用人類和小鼠細(xì)胞以及不同的DNA雙鏈斷裂(DSBs)誘導(dǎo)因子和測(cè)序平臺(tái)對(duì)BLESS法進(jìn)行驗(yàn)證。BLESS能夠識(shí)別端粒末端、SCE核酸內(nèi)切酶誘導(dǎo)的DNA雙鏈斷裂以及復(fù)雜的DSB全基因組。作為一種原理證明，我們讓人類細(xì)胞復(fù)制壓以敏感性基因組為特點(diǎn)，確定了> 2,000非均勻分布的阿非迪霉素敏感區(qū)(ASRS)，它們中基因過多，富含微衛(wèi)星重復(fù)序列。人類癌癥重排區(qū)也富含ASRS，許多癌癥相關(guān)的基因?qū)?fù)制壓具有極高的敏感性。

研究人員稱，這種新方法適合各種細(xì)胞核實(shí)驗(yàn)條件下DSBs全基因組作圖，其特異性和分辨率是現(xiàn)在的技術(shù)無法實(shí)現(xiàn)的。

SITE-Seq

研究人員研發(fā)出了一種新生化方法，通過測(cè)序（SITE-Seq方法）選擇性富集和識(shí)別標(biāo)記基因組DNA末端，從而在純化的基因組DNA中找到Cas9的切割位點(diǎn)。SITE-Seq是一種生物化學(xué)檢測(cè)方法，因此基因組DNA可以通過一系列sgRNP濃度進(jìn)行消化，從最低到最高，從而可以進(jìn)行高分辨率和低切割靈敏度的脫靶位點(diǎn)鑒別，這樣研究人員就可以細(xì)致全面的檢查細(xì)胞中可能的脫靶位點(diǎn)，檢測(cè)突變頻率和功能性細(xì)胞影響。而且SITE-Seq也能創(chuàng)建高度富集sgRNP切割片段的測(cè)序文庫(kù)，幫助以最小的讀取深度進(jìn)行特異性分析，這是將SITE-Seq作為高通量指導(dǎo)選擇工具的一個(gè)至關(guān)重要的特征。

最終，研究人員利用SITE-Seq來描繪了一組sgRNP生化切割的圖譜，檢測(cè)了靶向人類基因組的sgRNA的Cas9特異性，這些位點(diǎn)的數(shù)目取決于sgRNA序列和核酸酶濃度，在較低濃度下鑒定的位點(diǎn)顯示出細(xì)胞中脫靶突變的傾向性較高，脫靶位點(diǎn)列表也指出細(xì)胞內(nèi)Cas9活性受到sgRNP遞送，細(xì)胞類型和暴露于核酸酶的持續(xù)時(shí)間的影響?！禢ature Methods》：CRISPR-Cas9全基因組剪切位點(diǎn)圖譜

CIRCLE-seq

麻省總醫(yī)院和哈佛大學(xué)的研究人員介紹了一種新的體外篩查方法CIRCLE-seq。他們認(rèn)為，這種方法在鑒定全基因組的CRISPR/Cas9脫靶突變上，比現(xiàn)有的細(xì)胞或生化方法表現(xiàn)更佳。

研究人員認(rèn)為，這種方法可以鑒定與細(xì)胞類型特異的單核苷酸多態(tài)性相關(guān)的脫靶突變，證明了它有望生成個(gè)性化的特異性圖譜。同時(shí)CIRCLE-seq為鑒定全基因組范圍的脫靶突變提供了一種快速全面的方法。

研究人員也檢測(cè)了新方法的靈敏度。他們獲得了針對(duì)HBB基因的向?qū)NA的脫靶結(jié)果，并將這個(gè)圖譜與另一種鑒定方法（Digenome-seq）獲得的圖譜進(jìn)行比較。他們發(fā)現(xiàn)，CIRCLE-seq鑒定出Digenome-seq所發(fā)現(xiàn)的29個(gè)脫靶位點(diǎn)中的26個(gè)，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)了156個(gè)新位點(diǎn)。全面檢測(cè)CRISPR脫靶效應(yīng)的新策略

來源：生物通