發(fā)布日期：2017-10-09

今日，瑞典時(shí)間10月4日11點(diǎn)45分（北京時(shí)間10月4日17點(diǎn)45分），一年一度的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)?wù)綄ν夤?。雅?middot;杜波切特(Jacques Dubochet)、阿希姆·弗蘭克(Joachim Frank)和理查德·亨德森(Richard Henderson)被授予了該獎(jiǎng)項(xiàng)。以表彰他們“發(fā)展冷凍電子顯微鏡技術(shù)，以很高的分辨率確定溶液里的生物分子結(jié)構(gòu)”方面的貢獻(xiàn)。

根據(jù)諾貝爾獎(jiǎng)官網(wǎng)消息，雅克·杜伯謝1942年出生于瑞士，現(xiàn)在瑞士洛桑大學(xué)任教；約阿希姆·弗蘭克1940年出生于德國，現(xiàn)在美國哥倫比亞大學(xué)任教；理查德·亨德森1945年出生于蘇格蘭，現(xiàn)供職于英國劍橋MRC分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室（MRC Laboratory of Molecular Biology）。

科學(xué)的進(jìn)步往往取決于肉眼看不到物體的可視化突破，而冷凍電子顯微鏡技術(shù)的不斷進(jìn)展則為我們在生物分子領(lǐng)域的研究帶來更多可能性。

冷凍電鏡技術(shù)為何摘得2017年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)

文/何萬中（北京生命科學(xué)研究所研究員）

2013年，冷凍電鏡技術(shù)的突破給結(jié)構(gòu)生物學(xué)領(lǐng)域帶來了一場完美的風(fēng)暴，迅速席卷了結(jié)構(gòu)生物學(xué)領(lǐng)域，傳統(tǒng)X射線、傳統(tǒng)晶體學(xué)長期無法解決的許多重要大型復(fù)合體及膜蛋白的原子分辨率結(jié)構(gòu)，一個(gè)個(gè)被迅速解決，紛紛強(qiáng)勢占領(lǐng)頂級(jí)期刊和各大媒體版面，比如程亦凡博士、施一公博士、楊茂君博士、柳正峰博士所解析的原子分辨率重要復(fù)合體結(jié)構(gòu)，震驚世界。

這場冷凍電鏡革命的特點(diǎn)是：不需要結(jié)晶且需要樣品量極少，即可迅速解析大型蛋白復(fù)合體原子分辨率三維結(jié)構(gòu)。這場電子顯微學(xué)分辨率革命的突破有兩個(gè)關(guān)鍵技術(shù)：直接電子相機(jī)（其中算法方面程亦凡博士和李雪明博士有重要貢獻(xiàn)）和三維重構(gòu)軟件。

引領(lǐng)這些技術(shù)突破的背后離不開三位冷凍電鏡領(lǐng)域的開拓者：理查德·亨德森（Richard Henderson）、約阿希姆·弗蘭克（Joachim Frank）和 Jacques Dubochet分別在基本理論、重構(gòu)算法和實(shí)驗(yàn)方面的早期重要貢獻(xiàn)。

我本人與這三位科學(xué)家都有曾過面對面的交流，也是讀他們的文章進(jìn)入這個(gè)領(lǐng)域的，下面簡要談?wù)勊麄兊呢暙I(xiàn)。

電子顯微鏡于1931年發(fā)明，但在生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用滯后于材料科學(xué)，原因在于生物樣品含水分才會(huì)穩(wěn)定，而電子顯微鏡必須在高真空下才能工作，因此如何制作高分辨率生物電鏡樣品是個(gè)技術(shù)瓶頸。傳統(tǒng)的重金屬負(fù)染技術(shù)，可以讓重金屬包被蛋白表面，然后脫水干燥制作適合真空成像的樣品，但這會(huì)導(dǎo)致樣品分辨率降低（至多保存1.5納米）。

1968年，英國劍橋大學(xué)MRC實(shí)驗(yàn)室的Klug博士和他的學(xué)生DeRosier開創(chuàng)了基于負(fù)染的噬菌體病毒的電鏡三維重構(gòu)技術(shù)（Klug 博士獲1982年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)）。但如何保持生物樣品原子分辨率結(jié)構(gòu)又適合電鏡成像呢？加州大學(xué)伯克利分校的Robert Glaeser博士和他學(xué)生Ken Taylor 于1974年首次提出并測試了冷凍含水生物樣品的電鏡成像，可以有效降低輻照損傷對高分辨率結(jié)構(gòu)破壞和維持高真空，實(shí)現(xiàn)高分辨率成像的新思路，這就是冷凍電鏡（CryoEM）的雛形。

冷凍電鏡樣品制作流程，圖片來自creative-biostructure.com

1982年，Dubochet 博士領(lǐng)導(dǎo)的小組開發(fā)出真正成熟可用的快速投入冷凍制樣技術(shù)制作不形成冰晶體的玻璃態(tài)冰包埋樣品，隨著冷臺(tái)技術(shù)的開發(fā)，冷凍電鏡技術(shù)正式推廣開來。

在Klug博士提出的三維重構(gòu)技術(shù)基礎(chǔ)上，MRC實(shí)驗(yàn)室的Richard Henderson博士（物理學(xué)及X射線晶體學(xué)背景）跟同事Unwin 博士1975年開創(chuàng)了二維電子晶體學(xué)三維重構(gòu)技術(shù)，隨后應(yīng)用該技術(shù)技術(shù)解析了第一個(gè)膜蛋白細(xì)菌視覺紫紅質(zhì)蛋白的三維結(jié)構(gòu)，1990達(dá)到3.5埃，這是一個(gè)非常了不起的工作，但是第一個(gè)類似的膜蛋白結(jié)構(gòu)的諾貝爾獎(jiǎng)還是被X射線晶體學(xué)家米歇爾于1988年奪走了。二維晶體最大問題在于很難長出二維晶體，因而應(yīng)用范圍很窄，且容易被X射線晶體學(xué)家搶了飯碗（本人剛?cè)胄械谝粋€(gè)薄三維晶體項(xiàng)目就被搶了）。

上世紀(jì)90年代，Henderson博士轉(zhuǎn)向了剛興起的另一項(xiàng)CryoEM三維重構(gòu)技術(shù)，即Joachim Frank 博士發(fā)展的單顆粒分析重構(gòu)技術(shù)，無需結(jié)晶就可以對一系列蛋白或復(fù)合體顆粒直接成像，對位平均分類，然后三維重構(gòu)。Henderson 博士憑借他深厚的物理學(xué)及電子顯微學(xué)功底，以及非凡的洞察力，提出實(shí)現(xiàn)原子分辨率CryoEM技術(shù)的可行性，在理論上做了一系列超前的預(yù)見，比如電子束引起的樣品漂移必須解決才能實(shí)現(xiàn)原子分辨率，為后期直接電子相機(jī)的突破指明了方向，他本人也投身于直接電子相機(jī)的開發(fā)。

因此，在這場電鏡分辨率的革命中，Henderson博士是個(gè)不折不扣的發(fā)起者。另外，三維重構(gòu)新算法的突破也與Henderson 博士的獨(dú)具慧眼有關(guān)，Sjors Scheres博士在沒有很強(qiáng)論文情況下被他看中招募到MRC后因?yàn)殚_發(fā)經(jīng)典的Relion 三維重構(gòu)算法大放異彩。

最后，我們再介紹一下發(fā)展冷凍電鏡單顆粒三維重構(gòu)技術(shù)的Joachim Frank博士，他也是物理學(xué)背景。Frank 博士是單顆粒分析鼻祖，單顆粒三維重構(gòu)算法及軟件Spider的作者。

Frank 師從德國著名的電子顯微學(xué)家Hoppe博士，Hoppe學(xué)派主張對任意形狀樣品直接三維重構(gòu)，后來的電子斷層三維重構(gòu)及cryoEM三維重構(gòu)技術(shù)都與他的早期思想有關(guān)。Frank博士提出基于各個(gè)分散的全同顆粒（蛋白）的二維投影照片，經(jīng)過分類對位平均，然后三維重構(gòu)獲得蛋白的三維結(jié)構(gòu)，發(fā)展了一系列算法并編寫軟件（SPIDER）實(shí)現(xiàn)無需結(jié)晶的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)解析技術(shù)。尤其在核糖體三維重構(gòu)方面有一系列的重要開創(chuàng)性工作，可惜當(dāng)年核糖體結(jié)構(gòu)諾貝爾獎(jiǎng)沒有給他。現(xiàn)在給他在cryoEM單顆粒三維重構(gòu)的一個(gè)諾貝爾獎(jiǎng)，實(shí)至名歸。

來源：醫(yī)谷綜合報(bào)道