發(fā)布日期:2018-06-27
Anal Chem雜志最新刊出了一篇浙江大學(xué)附屬第二醫(yī)院/轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院王本老師組報道的外泌體定量新技術(shù)的文章,該文章第一作者是實驗室博士后田慶常博士。
外泌體是細(xì)胞分泌的具有磷脂雙分子層的納米囊泡,其膜性質(zhì)與細(xì)胞膜類似?;谶@一性質(zhì),我們利用細(xì)胞表面工程技術(shù)對外泌體膜進(jìn)行了有目的的修飾。
目前流行的數(shù)字PCR技術(shù)是用來定量檢測核酸的一種技術(shù),其基本原理是將有限的DNA分子隨機分配到大量小室中,在小室多于DNA分子的情況下,每個小室中的核酸分子多于一個DNA分子的概率非常低,然后對眾多小室中的DNA進(jìn)行擴增,結(jié)果是帶有DNA分子的小室會呈現(xiàn)陽性信號,而沒有DNA分子的小室呈現(xiàn)陰性信號。最后通過計數(shù)小室中陽性孔的量來計數(shù)原始的DNA濃度。
這篇文章中,我們將此數(shù)字檢測的原理用于外泌體檢測。外泌體是處于30-150 納米左右的納米顆粒,其在液體溶液中具有很好的分散性,在芯片中也像核酸分子一樣隨機分配,因此可以利用數(shù)字檢測的方法來對外泌體進(jìn)行定量。
工作原理如圖所示,能插入磷脂雙分子層的類磷脂分子(BAM)與合成的DNA分子合成為BAM-DNA分子。然后BAM-DNA被用于標(biāo)記外泌體,此標(biāo)記過程簡單易操作。標(biāo)記完成的溶液中可能存在大量的未標(biāo)記到外泌體上的BAM-DNA分子,需進(jìn)一步的進(jìn)行分離。本工作利用100 kd的超濾管用于分離標(biāo)記的外泌體和未標(biāo)記的BAM-DNA(分子量20 kd左右)分子。
標(biāo)記且純化后的外泌體帶有目的DNA分子,通過核酸檢測的方法可以通過檢測DNA分子來檢測標(biāo)記的外泌體。本文章采用了一種等溫方法來檢測外泌體表面的DNA。
標(biāo)記后的外泌體被分配到芯片中的小室中,基于上述的數(shù)字檢測的方法,經(jīng)過核酸擴增反應(yīng),帶有外泌體的小室,會呈現(xiàn)陽性信號,而其他的小室呈現(xiàn)陰性信號,通過計數(shù)這些“0101011”的數(shù)字信號而進(jìn)行外泌體計數(shù),實現(xiàn)對總外泌體的定量。
此外,我們還可以對總外泌體中的特異性外泌體進(jìn)行抗體-DNA標(biāo)記,通過檢測抗體-DNA而對特異性的外泌體進(jìn)行檢測和定量。
目前外泌體定量一般采用動態(tài)光散射的方法進(jìn)行納米顆粒計數(shù),該技術(shù)設(shè)備昂貴且稀少,不利于大規(guī)模研究的開展。而該文報道的方法以數(shù)字PCR技術(shù)為啟發(fā),建立了一種納米囊泡的定量方法,期望該方法進(jìn)一步發(fā)展能將DNA定量技術(shù)和設(shè)備用于外泌體定量,為基礎(chǔ)研究和臨床診療中的外泌體檢測提供一種簡單易行的方法。
來源:材料轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)